NGS測(cè)序?yàn)槭裁葱枰膸鞓?gòu)建?

NGS即Next-generation sequencing，又叫第二代測(cè)序技術(shù)或者高通量測(cè)序技術(shù)或者下一代測(cè)序技術(shù)。

文庫是DNA/RNA樣本在測(cè)序前做的一系列準(zhǔn)備，因?yàn)樵嫉暮怂針颖緹o法直接用于測(cè)序，只有經(jīng)過處理的樣本才能滿足測(cè)序平臺(tái)的要求，比如在DNA樣本兩端添加測(cè)序bi備的接頭；樣本量不足時(shí)，可以通過PCR擴(kuò)增達(dá)到上機(jī)的要求等。NGS測(cè)序?yàn)槭裁葱枰膸鞓?gòu)建?讓我們一起來看看吧！

一、DNA文庫構(gòu)建的內(nèi)容

（1）片段化及末端修復(fù)

（2）加接頭

（3）PCR

注意：此處忽略磁珠純化的步驟。

RNA樣本的文庫構(gòu)建更加復(fù)雜，需將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA才能進(jìn)行上述的建庫流程，原理相同。

二、gDNA樣本在NGS建庫前要進(jìn)行片段化的原因

Illumina測(cè)序儀可讀取的片段長(zhǎng)度范圍在50-600bp（圖1）, 不同測(cè)序芯片和測(cè)序試劑，對(duì)應(yīng)測(cè)序長(zhǎng)度不同。而大部分完整人類gDNA長(zhǎng)度≥10kb。所以對(duì)于大片段的DNA/RNA樣本，打斷是文庫構(gòu)建的前提。(這個(gè)理由同樣適用于MGI平臺(tái))

圖1.Illumina測(cè)序平臺(tái)針對(duì)不同應(yīng)用推薦的測(cè)序讀長(zhǎng)

三、DNA片段化后要加接頭(adapter/index)的原因和意義

一個(gè)完整的接頭包含三部分:通用引物(P5&P7) + index(i7/i5) + 測(cè)序引物(SP1&SP2)（圖2）

1. 通用引物用于簇生成，測(cè)序引物用于插入片段的測(cè)序；
2. 測(cè)序平臺(tái)決定接頭序列;
3. index用于區(qū)分同一批測(cè)序數(shù)據(jù)的不同樣本。當(dāng)同一張芯片測(cè)序樣本數(shù)≥2時(shí)，由index來區(qū)分樣本。如果一張flow cell只上一個(gè)樣本，index可以不需要，但是通用引物(P5&P7)和測(cè)序引物(SP1&SP2)是必需的。

備注：樣本加上完整接頭的方式有至少有3種，但是最終文庫的接頭序列是一致，找時(shí)間專門寫一個(gè)接頭不同結(jié)構(gòu)與連接方式的文章。

圖2 不同接頭結(jié)構(gòu)的文庫

四、PCR和PCR-free兩種文庫的常見性問題

PCR是實(shí)現(xiàn)樣本量的手段之一。當(dāng)投入的起始量較低，構(gòu)建的文庫量較少，需要通過 PCR復(fù)制模板量，最終達(dá)到上機(jī)需求的量。反之，當(dāng)樣本起始量足夠多的情況下，只需完成接頭連接，純化后即可上機(jī)測(cè)序。

但是PCR文庫比較常見。
1. 大部分樣本的起始量并不能直接滿足上機(jī)需求
2. 不經(jīng)過PCR擴(kuò)增的文庫，由于接頭呈現(xiàn)Y型，其物理結(jié)構(gòu)特殊，容易導(dǎo)致文庫質(zhì)控結(jié)果出現(xiàn)偏差

3. 接頭與模板比例高，純化不干凈，導(dǎo)致文庫的接頭殘留嚴(yán)重，降低整個(gè)文庫質(zhì)量

五、不同試劑盒對(duì)樣本起始量要求不同

不同試劑盒會(huì)有不同的樣本起始量要求。試劑盒能滿足的樣本起始量主要是由它自身酶的靈敏度、特異性以及穩(wěn)定性決定的。樣本起始量越低 (如新冠鼻咽拭子樣本)，對(duì)酶的要求越高，相對(duì)的價(jià)格也越高。而且針對(duì)低起始量樣本建庫的試劑盒都有各自的技術(shù)zhuan利和優(yōu)勢(shì)，所以也是價(jià)格高的另一個(gè)原因。

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