qPCR曲線常見(jiàn)問(wèn)題有哪些？如何解決？

在 qPCR 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)遇到異常擴(kuò)增曲線和熔解曲線的困擾，那么qPCR曲線常見(jiàn)問(wèn)題有哪些呢？該如何解決呢？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、擴(kuò)增曲線相關(guān)問(wèn)題

1.無(wú)擴(kuò)增曲線

可能原因：

（1）沒(méi)有打開(kāi)熒光信號(hào)采集。檢查程序設(shè)置，三步法擴(kuò)增程序在 72℃ 延伸階段采集信號(hào)，兩步法擴(kuò)增程序的信號(hào)采集設(shè)置在退火延伸步驟。

（2）引物降解。可通過(guò) PAGE 電泳檢驗(yàn)引物的完整性。

（3）模板濃度低。建議增加模板投入量或重新制備較高濃度模板。

2. 擴(kuò)增曲線不光滑

可能原因：

（1）儀器長(zhǎng)時(shí)間未校準(zhǔn)，在檢測(cè)中出現(xiàn)了波動(dòng)，建議定期校準(zhǔn)儀器；

（2）RNA 模板不純，建議增大模板稀釋倍數(shù)或者重新制備較高純度的 RNA 模板。

3. 擴(kuò)增曲線平臺(tái)期抖動(dòng)

可能原因：儀器與管材不匹配導(dǎo)致的信號(hào)采集產(chǎn)生波動(dòng)。

4. 擴(kuò)增曲線右下方下落呈倒扣狀

可能的原因：模板濃度過(guò)高，基線終點(diǎn)值大于 CT 值，儀器默認(rèn)起峰位置仍為基線期，將起峰位置往基線下拉，所以擴(kuò)增曲線變成了倒扣的 S 形（左圖）。可適當(dāng)減小基線范圍，手動(dòng)調(diào)整基線終點(diǎn)值至 CT 值 -4，調(diào)整基線范圍后，擴(kuò)增曲線即恢復(fù)正常（右圖）。

二、熔解曲線相關(guān)問(wèn)題

1. 有擴(kuò)增曲線無(wú)溶解曲線

可能原因：檢查是否有設(shè)置熔解曲線步驟或熔解曲線信號(hào)采集是否打開(kāi)。

2. 熔解曲線雜峰

（1）雜峰在主峰之前

可能的原因：雜峰在主峰之前，Tm 在 70～75℃ 范圍內(nèi)，一般是引物二聚體。引物二聚體是引物 3’ 端的部分堿基互補(bǔ)結(jié)合，在 Taq 酶的作用下，3’ 端延伸后得到的小分子量的雙鏈 DNA 片段。可根據(jù) NTC（無(wú)模板陰性對(duì)照）判斷是否為引物二聚體。

解決方案：建議通過(guò)提高模板濃度、提高退火溫度、降低引物濃度來(lái)改善。

（2）雜峰在主峰之后

可能的原因：非特異性擴(kuò)增，可能由于引物特異性較差，或體系中有氣溶膠污染（可結(jié)合 NTC 確定體系是否有污染）。建議先提高退火溫度，可提高擴(kuò)增特異性。如果提高退火溫度對(duì)于特異性沒(méi)有改善，建議更換特異性較高的引物。

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