影響熒光原位雜交實驗的因素有哪些？

熒光原位雜交是一門新興的分子細胞遺傳學技術，是 20 世紀 80 年代末期在原有的放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性原位雜交技術。那么影響熒光原位雜交實驗的因素有哪些呢？讓我們一起來看看吧！

一、固定液的選擇及固定時間

①石蠟組織建議用10%中性緩沖福爾馬林固定12～48h，其它固定液對實驗結果可能產生一定的影響。

②組織標本離體后應盡快固定，較大標本切開固定。如樣本固定不及時，熒光信號會減弱。（尤其環境溫度較高時更應及時固定）

③固定液體積應不少于標本體積的10倍，否則固定不充分，容易出現無信號或者信號很弱的現象。

④為了保證信號的準確性，蠟塊最好在2年內進行檢測，已經切好的切片在6周內檢測最佳。

二、組織切片和載玻片的選擇

組織切片4～5μm厚，過厚或過薄的切片均會對信號的強弱產生影響，切片過厚將導致雜交不充分，最終信號點發生重疊，影響計數。而且切片應完整，質量良好，否則會在預處理時掉片。

載玻片的選擇建議使用防脫載玻片，有條件的實驗室可使用更好的陽離子或者陰離子專用載玻片，可有效防止脫片現象的發生。

三、切片的預處理

切片預處理過程包括煮沸處理和蛋白酶消化。

①當組織處理不規范、切片過厚或烤片不足時，在煮沸過程中容易掉片，建議烤片溫度在56℃過夜。煮沸過程中要嚴格控制實驗溫度和時間。

②酶消化是FISH實驗的關鍵步驟之一，如果對組織不熟悉，可以先消化推薦的反應時間，然后復染DAPI在熒光顯微鏡下觀察，在DAPI通道下，以細胞既無空洞(消化過度)，亦無明顯的云霧狀(消化不足)為最佳，同時可切換觀察紅綠通道，以紅綠通道無明顯的背景為佳，如果背景較高，可適當延長消化時間。

③對于陳舊的石蠟組織切片，要適當延長消化時間，否則會出現大量的自發熒光。

四、變性和雜交

變性和雜交是本實驗最關鍵的步驟，變性的時間和溫度是雜交成功是否的關鍵，變性和退火溫度對熒光信號影響較大，變性和退火溫度過低會導致雜交效率變低，使熒光信號變弱，變性和退火溫度過高易出現高背景。

為保證變性期間溫度的穩定，建議采用專業的原位雜交儀進行變性和雜交步驟，不僅能夠減少實驗的繁瑣性，而且更有利于實驗條件的控制，比如時間、溫度和避光條件等。

為避免雜交液在變性和雜交過程中的損失和防止干片，一定要在蓋玻片的四周用橡膠水泥進行密封。

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