DNA提取試劑盒的原理是什么？

如今，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都使用商業(yè) DNA 提取試劑盒，這些試劑盒使用硅膠自旋過(guò)濾法來(lái)獲得高質(zhì)量的 DNA。這些可以快速有效地純化 DNA（或 RNA）。那么DNA提取試劑盒的原理是什么呢？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、RNA和DNA提取

裂解：裂解公式可能因您要提取 DNA 還是 RNA 而異，但共同點(diǎn)是含有高濃度離液鹽的裂解緩沖液。

Chaotropes（離液劑）的作用：Chaotrope會(huì)破壞氫鍵及疏水間的相互作用。離液鹽包括鹽酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸鋰。

洗滌劑：除了離液劑外，裂解緩沖液中通常還有一些去污劑，以幫助蛋白質(zhì)溶解和裂解。

溶菌酶和蛋白酶K:根據(jù)樣品類(lèi)型，也可以使用酶進(jìn)行裂解。蛋白酶 K 就是其中之一，實(shí)際上在這些變性緩沖液中效果較好；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)變性增多，蛋白酶 K 的作用也會(huì)相應(yīng)增強(qiáng)。然而，溶菌酶在變性中不起作用，因此溶菌酶處理通常在添加變性鹽之前進(jìn)行。

二、關(guān)于質(zhì)粒制備的注意事項(xiàng)

分離質(zhì)粒 DNA 與提取 RNA 或基因組 DNA 的提取方式是不相同的，因?yàn)楸仨氋|(zhì)粒與基因組 DNA 必須分離。如果此刻，您加入離液劑將立即釋放所有物質(zhì)，并且無(wú)法將小環(huán)狀 DNA 與高分子量染色體區(qū)別開(kāi)來(lái)。因此，在質(zhì)粒制備過(guò)程中中，直到裂解后才加入離液劑，鹽用于結(jié)合。

三、DNA 提取后純化：將 DNA 與色譜柱結(jié)合

離液鹽對(duì)于裂解至關(guān)重要，而且對(duì)于將 DNA（或 RNA）與色譜柱結(jié)合也是如此。此外，為了增強(qiáng)和影響核酸與二氧化硅的結(jié)合，還添加了酒精。

大多數(shù)情況下這是乙醇，但有時(shí)可能是異丙醇。乙醇百分比和體積有很大的影響。太多，你會(huì)帶入大量降解的核酸和小物種，這會(huì)影響 A260 讀數(shù)并降低你的一些產(chǎn)量。太少，可能難以從膜上洗掉所有鹽分。

如果您在裂解中使用含有 SDS 的去污劑，請(qǐng)嘗試使用NaCl 作為沉淀劑，以避免去污劑污染 DNA 或 RNA。

四、洗滌 DNA（或 RNA）

當(dāng)裂解物通過(guò)硅膠膜進(jìn)行離心分離，現(xiàn)在所提取的 DNA 或 RNA 應(yīng)該與柱子結(jié)合，雜質(zhì)、細(xì)胞蛋白和多糖應(yīng)該已經(jīng)通過(guò)了。

但是，膜仍然被殘留的細(xì)胞蛋白質(zhì)和鹽弄臟。如果樣品來(lái)自植物，仍然會(huì)有多糖，也許一些色素留在膜上，或者如果樣品是血液，膜可能會(huì)被染成棕色或黃色。

洗滌步驟用于去除這些雜質(zhì)

通常有兩次洗滌，盡管這可能因樣品類(lèi)型而異。第一次洗滌通常會(huì)含有少量的離液鹽，以去除蛋白質(zhì)和有色污染物。這之后總是用乙醇洗滌以除去鹽。

如果開(kāi)始的準(zhǔn)備工作沒(méi)有大量蛋白質(zhì)，例如質(zhì)粒準(zhǔn)備或 PCR 清理，則只需要乙醇洗滌。去除離液鹽對(duì)于獲得高產(chǎn)量和高純度的 DNA 或 RNA 至關(guān)重要。一些試劑盒甚至?xí)靡掖记逑粗觾纱巍?/p>

如果殘留鹽分，核酸的洗脫會(huì)很差，A230讀數(shù)會(huì)很高，導(dǎo)致260/230的比率很低。對(duì)于無(wú)乙醇 DNA 和 RNA，需要進(jìn)行干法離心，乙醇洗滌后，大多數(shù)方案都有一個(gè)離心步驟來(lái)干燥柱子。這是為了去除乙醇，對(duì)于清潔的洗脫液是bi不可少的。

當(dāng)將 10 mM Tris 緩沖液或水應(yīng)用于膜進(jìn)行洗脫時(shí)，核酸會(huì)水合并從膜中釋放出來(lái)。如果色譜柱上仍有乙醇，則核酸無(wú)法wan全再水合。如果跳過(guò)干燥步驟會(huì)導(dǎo)致乙醇污染和低產(chǎn)量。很可能在 Nanodrop 上看不到乙醇吸光度，所以它不會(huì)出現(xiàn)在您的讀數(shù)中。

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