WB-考馬斯亮藍(lán)染色法

一、考馬斯亮藍(lán)結(jié)構(gòu)

考馬斯亮藍(lán)R-250和G-250染料是二磺酸化三苯基甲烷化合物的兩種化學(xué)形式，結(jié)構(gòu)上R-250比G-250少了2個(gè)甲基。

二、蛋白質(zhì)染料要求

用染料和生物大分子結(jié)合形成有色的復(fù)合物是電泳后檢測(cè)常用的方法。選用染料通常應(yīng)考慮以下要求：
1. 必須與大分子結(jié)合以形成一個(gè)不溶性的，有色的，緊密的復(fù)合物，但不結(jié)合到凝膠中和支持膜上，以便從凝膠中除去，否則高背景會(huì)影響蛋白帶的辨別和定量掃描。
2. 染料必須容易溶解在對(duì)大分子沒(méi)有影響的溶劑中，以利于背景的脫色。
3. 選用高吸光系數(shù)的染料有利于提高定量測(cè)定的靈敏度。
4. 選用能與大分子有專(zhuān)一性結(jié)合的染料，并在結(jié)合后能產(chǎn)生不同的顏色（如熒光)，可以提高檢測(cè)的選擇性和靈敏度。

三、考馬斯亮藍(lán)染色的應(yīng)用

考馬斯亮藍(lán)又稱(chēng)為Bradford法，是一種常用的蛋白定性定量分析方法。其主要利用Coomassie Brilliant Blue G-250這種酸性染料與蛋白質(zhì)在酸性環(huán)境下產(chǎn)生吸附,導(dǎo)致染料的最大吸光波長(zhǎng)從465 nm變?yōu)?/font>595 nm。通過(guò)制備不同濃度的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品液,與Bradford試劑混合后測(cè)定其595 nm吸光度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。與標(biāo)準(zhǔn)品同量的樣品蛋白溶液與Bradford試劑混合。5 min后在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出各樣品的蛋白濃度。

此外，考馬斯亮藍(lán)（Coomassie Brilliant Blue）與麗春紅染色一樣，也是WB實(shí)驗(yàn)中常用的染色方法。

四、考馬斯亮藍(lán)染色的步驟

（1）電泳結(jié)束后，將膠板取出放入加有超純水的平皿中潤(rùn)洗，以去除殘留電泳液。

（2）之后加入考馬斯亮藍(lán)染液浸沒(méi)，放至水平搖床室溫30 min或更長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行染色（具體根據(jù)凝膠厚度和溫度進(jìn)行調(diào)整），直至凝膠與染色液顏色十分接近。

（3）棄去染色液或回收染色液（可回收使用3次左右）。

（4）脫色直至背景清晰。

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